Revista Farmabiotec 22

42 farmaBIOTEC #22 como para el producto final con el nanosistema ( drug product o) [7,8] . Estos atributos deben ser monitorizados para garantizar la seguridad, eficacia y consistencia del producto, ya que influyen directamente en su rendi- miento biológico y farmacológico. En el caso del ARNm como principio activo, los CQAs más relevantes inclu- yen la identidad, la pureza e integridad del transcrito, y las impurezas [9] . La identidad hace referencia a la correcta estructura molecular del ARNm, incluyendo la presencia de la pro- tección a 5’, las modificaciones nucleotídicas y la lon- gitud de la cola poli-Adeninas en 3’. Cada uno de estos elementos influye en la estabilidad y en la eficiencia de traducción. En la pureza e integridad se evalúa que el transcrito sea de longitud completa y que los productos de degra- dación sean mínimos. En las impurezas , se controlan contaminantes deri- vados del proceso de síntesis, como ADN plantilla resi- dual, enzimas de transcripción, ARN de doble cadena (dsRNA), nucleótidos (NTPs) o análogos de la protec - ción libres. Estas pueden reducir la eficacia o inducir respuestas inflamatorias [10] . El control riguroso de estos parámetros es esencial y garantizar los CQAs del ARNm requiere herramientas analíticas de última generación. Entre ellas, las meto- dologías basadas en cromatografía líquida acoplada a diferentes detectores, desde los más básicos (UV/FLU), hasta la espectrometría de masas (LC–MS), se han convertido en herramientas útiles por su versatilidad, sensibilidad y especificidad, adaptando metodologías desarrolladas para molécula pequeña y ampliamente utilizadas en la industria farmacéutica [11] . Estas estrate- gias se dividen en tres niveles complementarios: diges- tión total, digestión parcial y análisis intacto. En la digestión total , el ARNm se hidroliza comple - tamente mediante enzimas no específicas, como la nucleasa P1, generando un conjunto de nucleótidos libres. Estos se separan mediante cromatografía con fase estacionaria HILIC-Amide , la cual permite una reten- ción eficaz de estos compuestos altamente polares. De forma alternativa, puede incorporarse una segunda etapa de desfosforilación mediante una fosfatasa, que elimina los grupos fosfato y convierte los nucleótidos en nucleósidos. Este proceso reduce su polaridad y posibilita su separación mediante cromatografía de Terapia génica Figura 3. A) Estrategia de digestión total y cuantificación de monofosfatos (A1) y del 5’ cap (A2). B) Estrategia de digestión parcial con el TIC de oligonucleótidos generados con diferentes RNasas (B1), MS de oligonucleótidos multicargados y espectro deconvolucionado para obtener el peso molecular (B2) y MS/MS con fragmentos asignados para la confirmación de la secuencia (B3). C) Cromatograma UV del ARNm intacto vía IP-RP LC-UV.