Revista Farmabiotec 22

#22 farmaBIOTEC 43 fase reversa convencional. Los productos obtenidos se detectan posteriormente mediante espectrometría de masas triple cuadrupolo (MRM), lo que permite una cuantificación precisa de los nucleótidos y la identifi- cación de modificaciones específicas, ofreciendo una visión global de la composición del ARNm [12] . No obs- tante, a pesar de su alta sensibilidad, esta estrategia presenta como principal limitación la pérdida de infor- mación sobre la secuencia y el contexto estructural. La digestión parcial genera fragmentos de oligonu- cleótidos de longitud definida que conservan informa- ción de secuencia y modificaciones. Para ello, se utili- zan endonucleasas específicas como RNasa T1 (corta específicamente en guanosinas), RNasa A (corta en ambas pirimidinas, en uracilos y citosinas) o RNasa 4 (corta específicamente en las combinaciones Uracilo con purinas, U-A y U-G). La especificidad del sitio de corte determina directamente la longitud de los frag- mentos obtenidos: cuanto más amplia es la especifici- dad de la enzima, más cortos son los oligonucleótidos generados; por el contrario, una mayor selectividad pro - duce fragmentos más largos, lo que, aunque mejora la información estructural, puede dificultar su ionización y la posterior detección. Los fragmentos resultantes se separan mediante cromatografía líquida en fase reversa con par iónico (IP-RP UHPLC) y se analizan por espectrometría de masas de alta resolución (QTOF) con modos de adquisición dependiente (DDA) e inde - pendiente (DIA), para adquirir los espectros de MS que confirman las multicargas de los oligonucleótidos, se deconvoluciona para obtener su masa molecular y los espectros de MSMS para confirmar la secuencia [13] . Gracias a esta combinación de RNasas, se consigue una cobertura de secuencia amplia y una identificación fiable de las modificaciones y su posición, generando este “fingerprint” característico, consolidándose como estrategia para el oligomapping del ARNm terapéutico. El análisis del ARNm intacto se realiza mediante téc - nicas convencionales de separación, como la cromato- grafía líquida o la electroforesis capilar, con detección por absorción ultravioleta (UV) o fluorescencia (FLU). Existen diversas estrategias cromatográficas aplicables a este tipo de biomoléculas, entre ellas la cromatogra- fía de fase reversa con par iónico (IP-RP), que emplea columnas de gran tamaño de poro (>1000 Å) para faci - litar la elución de macromoléculas, así como la croma- tografía de exclusión por tamaño (SEC) y la cromatogra - fía de intercambio aniónico (AEX). Estas metodologías permiten evaluar la longitud, integridad y contenido global del ARNm intacto [14] , y se han demostrado espe- cialmente útiles para cuantificar el ARNm encapsulado en nanopartículas, como producto final ( drug product ). La combinación de las tres estrategias analíticas ofrece una caracterización integral del ARNm terapéu - tico. Esta complementariedad no solo resulta esencial para cumplir con los requisitos regulatorios de carac- terización y control de calidad, sino que también refleja la versatilidad de las metodologías analíticas actuales para abordar la caracterización de estas biomoléculas de naturaleza tan compleja. Persisten, sin embargo, desafíos significativos, espe- cialmente en la interpretación de espectros de frag- mentación, que requiere herramientas bioinformáticas avanzadas capaces de manejar grandes volúmenes de datos y minimizar falsos positivos. Estas limitaciones han impulsado notables avances en los últimos 5 años, en estas estrategias híbridas, que amplían los límites de la caracterización de oligonucleótidos y consecuen - temente del ARNm. En el futuro, la estandarización, la automatización y el uso de herramientas bioinformáticas serán claves para fortalecer el control de calidad y transformar estos retos en oportunidades para la medicina de precisión [15] . Bibliografía • [1] Cannon G, et. al. DNA Cell Biol. 2002. doi:10.1089/104454902762053882. • [2] Karikó K, et. al. Curr Opin Drug Discov Devel. 2007. • [3] Pardi N, et. al. Nat Rev Drug Discov. 2018. doi:10.1038/ nrd.2017.243. • [4] Hou X, et. al. Nat Rev Mater. 2021. doi:10.1038/ s41578-021-00358-0. • [5] Navalón-López M, et. al. Nanoscale Adv. 2023. doi:10.1039/D2NA00800A. • [6] Giacobino C, et. al. Cancers (Basel). 2021. doi:10.3390/cancers13092280. • [7] European Medicines Agency (EMA). 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