Revista Farmabiotec Número 5

#5 farmaBIOTEC 37 son secretados por células vivas y en mayores cantidades que, por ejemplo, las CTC. Asimismo, se ha descrito que el ADN contenido en los exosomas (exoDNA) presenta mayor sensibilidad y especificidad en la detección de alteraciones que el ctDNA, incluso se ha descrito que muestran supe- rioridad a los biomarcadores convencionales basados en suero, como el antígeno carcinoembrionario, en cuanto a precisión diagnóstica. Sin embargo, una de las principales ventajas reside en la estabilidad conferida al ARN que por- tan en su interior. Por todo ello, los exosomas presentan un gran potencial como herramientas para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la evolución de los pacientes. Sin embargo, su traslación a la práctica clínica está limi- tada por la falta de un método de aislamiento estandari- zado, que sea sencillo, eficiente y reproducible. Actualmente las principales aplicaciones de los exoso- mas son como biomarcadores, sistemas de administra- ción de fármacos, terapias y las vacunas contra el cáncer. Si realizamos una búsqueda en la base de datos de ensa- yos clínicos Clinicaltrials.gov, más del 50% de los mismos se centran en aplicaciones relacionadas con la búsqueda de biomarcadores exosomales. Métodos de aislamiento de exosomas Actualmente se emplean diferentes métodos de aisla- miento de exosomas que presentan ventajas y limitacio- nes, considerándose la ultracentrifugación diferencial (UC) el método de referencia. Esta técnica se basa en la separación secuencial de partículas por sedimentación en función de su tamaño y densidad. Se trata de un método relativamente sencillo y económico, pero presenta la des- ventaja de que requiere grandes volúmenes iniciales de muestra y los exosomas recuperados suelen presentar contaminación por proteínas co-precipitadas. Además, la ultracentrifugadora es un equipamiento costoso y con grandes dimensiones que no está disponible en todas las instalaciones. Por ello, recientemente, esta técnica de ais- lamiento está dejando paso a otras tecnologías que con- sumen menos tiempo y son más accesibles. El aislamiento por inmunoafinidad se basa en la presencia de proteínas de superficie o antígenos en la membrana de los exosomas. Se emplean anticuerpos que pueden estar unidos a diferentes soportes como placas de cultivo, beads magné- ticas, sistemas de microfluídica, etc. Esta tecnología permite aislar exosomas a partir de pequeñas cantidades de muestra, pero tiene la limitación, añadida al coste, de aislar subpobla- ciones de exosomas específicas, en función del anticuerpo empleado, lo que también lleva asociado un bajo rendimiento. El aislamiento mediante ultrafiltración (UF) se basa en el uso de membranas semipermeables con rangos de poros específicos que descartan primero las partículas más grandes y los exosomas se recuperan en un eluido. En este caso, el rendimiento es inferior al de la UC, los filtros pueden obstruirse y también se ha descrito la presencia de proteínas contaminantes. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) está superando a otras técnicas de aislamiento de EVs por los tiempos de procesamiento necesarios. Sin embargo, el rendimiento de exosomas extraídos es bajo, por lo que se requiere un gran volumen de partida. Aísla las diferentes vesículas ya que se ralentizan al entrar en los poros del gel, y permite recoger las diferentes fracciones en los elui- dos. Esta técnica puede preservar la estructura de las EVs mejor que la UC y la UF, sin embargo, no puede separar- las eficazmente de lipoproteínas o agregados proteicos de tamaño similar. El empleo de los exosomas como herramienta de diag- nóstico y seguimiento en clínica y en veterinaria presenta un futuro muy prometedor. En base a las ventajas de la LB en general y de las EVs, en particular, actualmente existen diferentes kits comerciales de aien Nexotech hemos desa- rrollado un kit comercial de purificación de EVs llamado ExoGAG. ExoGAG es un método rápido, tan sólo requiere 20minutos, y sencillo, siendo necesaria una centrifugadora de laboratorio convencional, para aislar exosomas a partir de un pequeño volumen de muestra. La ventaja de esta tecnología es que el tipo y las características de la matriz no condicionan el rendimiento a la hora de aislar exoso- mas, pudiendo emplearse en muestras de plasma, suero y orina, pero también leche, saliva o medio de cultivo. Así mismo, una vez aislados los exosomas en formato pellet, el rendimiento y la calidad de los mismos permite llevar a multitud de aplicaciones posteriores para caracterizar su contenido, tanto a nivel proteico (ELISA, WesternBlott, citometría) como genético (qPCR, ddPCR, NGS). Se trata de una tecnología robusta y eficiente en el aislamiento de EVs, con un rendimiento óptimo para la aplicación clínica y veterinaria. Diagnóstico in vitro