Revista Farmabiotec - Número 16

#16 farmaBIOTEC 39 características de sus vibraciones. Al incidir un haz de luz, ocurre la interferencia constructiva de frecuencias iguales, amplificando su longitud de onda. En otras palabras, parte de la luz es absorbida por la molécula, por lo tanto, la luz emitida tendrá una frecuencia diferente. Al detectar este desplazamiento de las frecuencias, es posible obtener un espectro Raman característico de la estructura química del compuesto. En el caso del agua (H 2 O), hay tres tipos diferentes de vibraciones, lo que resultaría en un espectro de tres picos a diferentes frecuencias (Figura 1). Desde sus inicios con el uso de arcos de mercurio como fuente de luz, la tecnología Raman ha evolucionado signifi - cativamente. La utilización láseres ha mejorado la sensibi- lidad y la precisión de las mediciones, ya que son capaces de emitir luz a una frecuencia única. En la actualidad, la espectroscopía Raman se ha convertido en una herra- mienta relevante en diversas industrias, incluyendo la bio- tecnología, donde se utiliza para monitorear parámetros en biorreactores (niveles de glucosa, ácido acético, etc.) y comienza a encontrar aplicaciones en diversas etapas del “Downstream”. En este artículo nos vamos a centrar en su potencial para monitorizar reacciones químicas y enzimá- ticas de forma directa y no invasiva. La reciente demanda de vacunas basadas en ARN mensajero, impulsada por la pandemia de COVID-19, ha incrementado la necesidad de métodos de control más eficientes para la reacción de transcripción in vitro ( In Vitro Transcription , IVT). Esta reacción enzimática permite la síntesis de ARN a partir de una plantilla de ADN en un reactor. Esta etapa es crucial y extremadamente sensible a las condiciones del proceso. Identificar el agotamiento de uno de los reactivos, la velocidad de la reacción o el punto óptimo de parada tiene un impacto directo en la pro- ductividad de la etapa. Los métodos analíticos tradicionales "offline" para cuantificar bases NTP (ATP, CTP, GPT y UPT) y ARN son demasiado lentos para un control activo de la reacción. En este contexto, la tecnología Raman ofrece una solu- ción prometedora, ya que proporciona un análisis en línea y en tiempo real de forma no invasiva, lo que podría trans- formar la forma en que se controla y optimiza este pro- ceso crítico Caso Práctico En este estudio de viabilidad, evaluamos el uso del ProCellics™ Raman Analyzer de Merck para monitorear la disminución de los NTP y la producción de ARN durante la reacción IVT. Objetivos - Demostrar una buena precisión para identificar precur - sores de ARN y ARN mensajero. - Demostrar una buena selectividad para identificar bases NTP. - Demostrar una buena capacidad de cuantificación de la concentración de cada componente Método y materiales Para la obtención de los espectros Raman se utilizaron bases NTP purificadas (Sigma-Aldrich ® ) a diferentes con- centraciones (0.89 a 16.67 mM). También se realizaron mezclas de estas con el fin de tener en cuenta posibles interacciones entre bases. Muestras de ARN mensajero de diferentes longitudes fueron proporcionadas por el equipo de innovación de Merck y diluidas en concentraciones de 0.1 a 3.5 g/L. (Figura 2). Las muestras se analizaron utilizando ProCellics™ Raman Analyzer, y los datos obtenidos se procesaron usando el software Raman PAT Bio4C ® . Con el fin de poder realizar medidas de muestras pequeñas (1.5 mL) y sin necesidad de inmersión de la sonda se utilizó un módulo de medida externa (Figura 3, A & B). Todas las muestras fueron medidas con un tiempo de integración Raman de 50 segundos x 3 espectros promedio, resultando en un total de 2 min y 30 segundos por medición (Figura 4). Análisis de resultados El análisis proporcionó diferentes espectros Raman que fueron procesados utilizando el software Raman Bio4C ® PAT para mejorar la señal, eliminar interferencias Tecnología analítica de Proceso (PAT) Figura 2: Representación esquemática del resultado de la prepara- ción de muestras. Figura 3: Procellics TM Raman Analyzer (A) y módulo de medida externa Procellics TM (B).